谁有化学生物学或化学遗传学的信息？

发布网友 发布时间：2022-04-20 03:51

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热心网友 时间：2023-06-24 16:24

《化学生物学》

化学生物学是自90年代中期以来的新兴研究领域. 哈佛大学的Schreiber博士和Scripps研究所的Schultz博士分别在东西海岸引领这个领域, 他们的所在地所形成的重心地位甚至在加强. 从源头来讲, 化学是研究分子的科学, 生物化学, 分子生物学, 还有生物学化学都是一样的. 但是由于科学家们长期以来的习惯称谓, 我们通常使用生物化学指蛋白质结构和活性的研究, 用分子生物学指基因表达和控制的研究, 用生物学化学指分子水平上的生物现象的研究. (如有错误或阁下有不同观点请不吝赐教)

Schreiber from East Schultz from West

与这些相比, 化学生物学使用小分子作为工具解决生物学的问题或通过干扰/调节正常过程了解蛋白质的功能.在某种意义上, 使用小分子调节目标蛋白质与制药公司发展新药类似. 但是, 当所有公司的目标蛋白质到目前为止仅是约450种的时候, 人类基因组计划为我们带来了至少几万个目标蛋白质. 最终的目标是寻找特异性调节素或寻找解开所有蛋白质之谜的钥匙, 但这需要更系统和整体的方法而并非传统方法. 化学生物学看起来是有希望的答案. 系统的化学生物学仅仅诞生于90年代中期, 部份是由于基础条件到那时才刚刚完备. 代表性的技术进步包括机器人工程, 高通量及高灵敏度的生物筛选, 信息生物学, 数据采集工具, 组合化学和芯片技术例如DNA芯片. 化学生物学更普遍的被叫做化学遗传学(chemical genetics), 而且它正在扩展到化学基因组学. 和经典遗传学相比较, 小分子并不是取代或超越基因表达, 而是被用于抑制或活化翻译过程.

Knockout à protein synthesis suppression vs molecular suppressor à protein activity suppression
Overexpression à protein synthesis activation vs molecular activator à protein activation

正如经典遗传研究方法一样, 化学遗传学中的正向法和逆向法都是可行的.

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:::::正向法化学生物学::::
在正向法中, 目标生物学现象第一次被定义, 然后引起被寻找现象的分子选择自许多被应用的分子. 被选择的分子能被附到某些蛋白质上而且抑制/活化它们, 引发重要的修饰, 然后与分子相连的蛋白质被检查并研究. 下面是使用正向法发现和发展肌基质蛋白的例子 Nat. Biotechnol. 2000, 18, 304-308.

1. 制得化合物: 首先, 为了获得足量得化合物以引发要得到的现象, 通过组合化学的合成方法制得嘌呤文库. 多种化合物可与放射性研究引起的不同变异相比较. 有关文库合成及应用在其它章节有详述.

2. 定义目标现象: 已经分化的神经原细胞和肌肉细胞很少被增殖. 因此, 一旦受伤, 细胞长不好, 恢复很难. 这项研究的最初目的是为了找到一种化合物来引起改变肌肉细胞分化, 达到再生目的. 分化的肌肉组织构成交织的管状结构. 几百个嘌呤类化合物被在96孔圆片上植入潜伏肌肉组织中, 找到了能够分离相连接的组织的化合物. 这种化合物自肌管(myotube) 隔断(severing) 嘌呤(purine)命名为myoseverin(肌基质蛋白). 事实上, 肌基质蛋白并不仅切断肌管分离细胞, 而且洗涤化合物并添加必需的养分以帮助增殖. 更令人激动的是如果增殖的细胞开始分化, 它们又造出肌管. 换言之, 如果这种化合物被注入组织, 一部分肌肉细胞就可期望再度生长并增殖, 因而产生新的肌肉组织.

药物处理前的肌肉细胞 肌基质蛋白处理后的肌肉细胞

3. 检查化合物相连的目标蛋白质: 虽然发现能够诱导需要的现象的化合物是最重要的前步骤, 对与化合物反应的目标蛋白质的细致检查然后理解其活性和角色才是真正的辛苦工作. 如果需要的现象定义得好, 是否存在活性化合物的研究结果可以在短时间内显示.
在肌基质蛋白的例子中, 当细胞结构迅速改变时, 预计细胞结构的构建蛋白质受到进攻, 可以使用带有荧光标记的抗体观察细胞图像. 然后是染色的肌球蛋白, 它是体细胞的重要组成部分. 绿色的是肌球蛋白, 蓝色的是核.

药物处理前的肌细胞 肌基质蛋白处理后的肌细胞

肌基质蛋白处理前后的差异是显而易见的. 在肌基质蛋白处理之前, 细胞被统一连接, 但是处理后, 可以看到细胞相互分离. 然而, 是否肌球蛋白是目标蛋白质还不能确定. 一些骨骼蛋白质是染色了的但是结果是相似的. 可是, 当使用微管蛋白使微管染色的时候, 却得到了有趣的数据. 同样, 绿色是微管蛋白, 蓝色是核.

药物处理前的肌细胞 肌基质蛋白处理后的肌细胞

在被肌基质蛋白处理之前, 与先前的照片类似, 细胞与微管紧密相连, 但是以肌基质蛋白处理过的细胞表现出破裂的微管. 因此, 一般猜测肌基质蛋白直接的或间接的攻击微管蛋白或微管. 微管是个管形结构, 含有a, b微管蛋白组合, 它参与了支持细胞结构和染色体运动.

微管蛋白(Tubulin)和微管(Microtubule)

<McGill Medical informatics>

微管蛋白有GTP连接位点, 也是制造微管过程中GTP水解制得GDP的GTP酶. 微管含有增长+末端和消除-末端. 在细胞*中, 染色体转移需要良好控制的微管的形成和破坏. 天然物质(vinca alkaloids, cholchicine), 破坏微管或阻止微管蛋白的合成, 干扰正常细胞的*. Cholchicine是被用于无核西瓜的物质. 从另一方面来说, 紫杉酚(taxol)过度稳定微管并阻止其动力学变化, 也因其停止正常细胞的*而被用于抗癌药. 为使微管正常工作, 微管联合蛋白(MAP)也非常重要. 所以, 还不清楚肌基质蛋白直接在微管蛋白还是其它MAP上发生功能. 为了检验这一点, 从Cytoskeleton中提取了纯净的微管蛋白, 它在特种溶剂中制造微管. 当微管被插入时, 管形结构明显消失. 所以, 这证实了肌基质蛋白直接在微管蛋白或微管上发生作用.

药物处理前的微管 肌基质蛋白处理后的微管

根据以前的经验, 已证明微管蛋白在体外被肌基质蛋白进攻, 但是在体内怎么样呢? 为了寻找具有生物活性的分子与之成键的蛋白质, 普通大小的固相树脂被用于活性分子的亲和力矩阵, 然后蛋白质被钓出. 肌基质蛋白上被加以连接分子, 然后与固相树脂相连做成钓索. 然后浸入细胞质混合物一段时间, 蛋白质与树脂相连并被分析. 然而, 由于肌基质蛋白的活性和蛋白质合成现在被中止, 这项工作不容易. 这是化学生物学方法中众所周知的问题.

修饰了亲和性的肌基质蛋白分子

钓出体内微管蛋白(1: 亲和分子, Ms: 肌基质蛋白)

在肌基质蛋白的例子中, 如果不是使用连接分子与树脂相连, 叫做链霉抗生素蛋白(Streptavidin)的生物素与蛋白质强烈成键, 一种强活性官能团的亲核分子. 这种方法的优点是引入了亲和分子, 简单的将其插入活细胞内就可与目标蛋白质成键, 而不是把细胞研碎而混合蛋白质. 如果目标蛋白质与分子成键, 化学活性基团将以共价键与蛋白质的亲核部分结合, 因而可以通过生物素使链霉抗生素蛋白体与目标蛋白质成键. 已证明实验后体内微管蛋白与亲和分子成键.

综上所述, 由筛选系统发现的肌基质蛋白使得已分化的肌细胞再生成为可能, 已证明微管蛋白引起了这种现象. 与经典遗传学相比, 人们可以掌握出现的目标基因并甚至得到控制目标蛋白质活性的小分子开关. 这种肌基质蛋白, 在经过实验后, 可被用作新的药物候选者.

:::::逆向法化学生物学::::
在逆向法中, 目标蛋白质受到化学物质进攻, 首先被分类, 然后可以通过观察插入相关化学物时的结果作用来分析目标蛋白质的体外功能. 这里有一个这种方法的实例: purvalanol的发展和应用. Chem. Biol. 1999, 6, 361-375.

1. 选择目标蛋白质: 细胞*是多种完备功能的蛋白质的和谐演出. CDK(细胞周期蛋白依赖性激酶)是每步细胞*中的控制开关蛋白质, 其中, CDK2参与了G1到S而CDK参与了G2到M. 一些寻找它们特定功能的研究非常活跃, 正在进展. 所以, 在这项研究中我们决定寻找能够抑制CDK1或CDK2功能的化合物.

细胞周期和CDK

2. CDK抑制剂的发展: 以正向法制得的嘌呤文库被用于在纯净的CDK1和CDK2上筛选酶抑制剂. 之所以使用嘌呤是为了让嘌呤类物质通过辅酶与ATP竞争结合位点. 为了加速筛选过程, 通过使用放射性标记的ATP和组蛋白在96圆片上使酶活化, 然后测量磷酸基自用硝基纤维素滤纸过滤出的蛋白质转移到组蛋白这过程中的所有的放射性. 由olomocine起始, 선도물질 (IC50 7mM), 几步重复之后我们得到约1000倍活化的purvalanol系列化合物. 这些化合物同等程度抑制CDK1和CDK2. 这是因为两种酶都是通过非常相似的路线建立起来的, 它们的ATP结合位点也相似.

3. Purvalanol在有丝*中的作用: 如果CDK1和2被抑制, 将有什么发生呢?由于众所周知的事实, 这些酶在有丝*的每一步都扮演了重要角色, 研究的第一步就是观察对易于观测有丝*的青蛙卵提取物的作用. 在这个实验中, 注入激素以诱发更多排卵, 从卵中提取出必要的物质. 当植入从青蛙精子提取的DNA时, 卵细胞误识其为受精, 并模仿细胞*. 通过控制中期(metaphase)Ca的数量可以中止细胞*. 卵细胞对这个实验非常有用, 因为它们含有大量的蛋白质. 为了使图片清晰, 核DNA染成蓝色而微管蛋白染成红色. 在正常阶段, DNA折叠以形成染色体并排成一行. 然后微管连到其上将其分到两边. 但是, 如果在这个阶段加入purvalanol, DNA不会完全折叠, 微管就找不到它们的连接位点. 这应该是进攻了G2到M的步骤. 可以说, 对CDK1的抑制强于CDK2. 另外, 如果肌基质蛋白同时被加入, DNA一点也不折叠, 而且微管结构完全消失. 这可能是G2阶段后紧随的M阶段的微管受到进攻.

正常的中期 purvalanol处理后 肌基质蛋白处理后

4. Purvalanol与蛋白质成键的确认: 为了查证哪一种蛋白质与purvalanol成键, 使用了琼脂树脂亲和力柱钓出未知的蛋白质. 通常, 在亲和力柱中, 由于柱中其它碱性物质的存在, 甚至一些没有任何选择性的蛋白质也与目标蛋白质一同获得. 为了分离这些不要的蛋白, 使用了以purvalanol类无亲和性物质做成的相对亲和力柱. 培养的卵提取物经柱子处理后过滤, 亲和力柱(Pur-97矩阵)在应用purvalanol前后(A)表现出非常相似的结果, 但是相对亲和力柱出现了正常有丝*的步骤(B). 结果说明亲和力柱仅吸附重要的蛋白质, 参与正常的有丝*, 在过滤步骤中与卵提取物分离. 因此, 一个可行的测试是到重新注入认为已被去处的蛋白质, 检查正常有丝*是否再次发生. 由于已发现purvalanol抑制CDK1或CDK2, 当每个酶被用于(A)情况的时候, CDK不显示任何变化, 但是CDK1清楚显示了紊乱有丝*步骤. 这个结果明确解释了CDK1是(A)状态的不足因素.

C-Matrix P-Matrix
Anti-CDK1 blot

C-Matrix P-Matrix

另一方面, (A)和(B)柱吸附的蛋白质被过滤而且以阴离子洗涤剂十二烷基磺酸钠(SDS)处理, 然后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离. 两柱都吸附的蛋白质被忽略, 考虑到它们在柱子上随机附着, 或者通常与嘌呤结构成键, 只有亲合性柱吸附的蛋白质被证实是CDK1.

5. 肌基质蛋白和purvalanol在其它细胞上的作用: 为了检查肌基质蛋白和purvalanol在卵提取物以外的其它活细胞上的作用, 也处理了U937, 一种白血病细胞. 蓝色是染色的DNA, 绿色是染色的微管. 小盒子是一个正在*的细胞. 在普通的中期, 着丝点*到细胞两边, DNA折叠中的微管在中间排列. 微管与它们连接然后将它们牵引到细胞的两端. 肌基质蛋白在没*的细胞上不产生作用, 但是通过破坏微管为离散结构而影响*的细胞. 同时, 以purvalanol处理的细胞表现出未收缩的DNA和已经*为两个但没有到达指定位置的着丝点. 这是在G2-M期中止的结果. 另外, 细胞变得比正常细胞大. 这是因为尽管中止了细胞周期, 细胞仍然进行蛋白质合成和新陈代谢.

正常中期 purvalanol处理 肌基质蛋白处理

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::::通过蛋白质的研究::::

化学生物学使用的大多数协议使用将小分子与天然蛋白质成键然后控制它们的方法. 然而, 当目标蛋白质在大的官能团中存在的时候, 选择性的控制每个蛋白质非常困难. 激酶(Kinase)在体内是一种使用ATP作磷酸化蛋白质及其它底物的辅助因子的酶. 蛋白质磷酸化, 是重要的信号传递系统的开关, 指导蛋白质结构的修饰. 当生长因子或激素绑到一个细胞表面上的受体时, 多种激酶逐渐活化, 信号被传输. 有时, 一种激酶通过磷酸化活化另一种. 因此, 如果我们能将某个激酶磷酸化特定蛋白质的途径做成谱图, 这将为解释细胞与细胞表面受体结合后细胞内信号如何传递提供重要线索. 一个研究方法是在存在以放射性标记磷酸基的ATP给出的信号同时, 检测蛋白质与放射性标记的P成的键. 虽然如此, 因为已经知道人体内存在数以千计的激酶, 找出每种激酶的功能并不容易, 因为它们有可能是逐步活化的, 也可能是平行的.

最近加州大学旧金山分校的Shokat博士发展了一种新的方法以解决这个问题. 每个激酶包含ATP成键位点, 而且它们有非常相似的结构. Shokat研究组选择了一种激酶, 他们想要研究它的功能, 将一些体积大的有ATP成键位点的氨基酸替换为一些小的氨基酸. 利用基因工程技术, 基本上仅有激酶本身被改变. 蛋白质有了游离的成键位点, 而且由于对ATP亲合性显著降低, 在磷酸化反应中已不能作催化剂. 当一个合适的修饰ATP分子被连接到游离的的位点时, 激酶恢复活性. 重要的是其它数以千计的激酶不使用这个被修饰的ATP作酶作用物. 瞧! 如果被修饰的ATP带有放射性标记并被插入细胞内, 所有放射性P标记的磷酸化的蛋白质都成为修饰了的激酶的酶作用物.

另一方面, 合成仅与游离的修饰后的ATP成键的选择性抑制剂不是很困难, 可以在不影响其它激酶的条件下研究有关的激酶的抑制. 这证明了从天然的蛋白质的经结构修饰得到的人造蛋白质, 能通过人造ATP维持生物活性. 这种方法代表了一个新的研究方向, 不仅是蛋白质信号传递研究的, 而且是整个生物学化学研究的.

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《化学遗传学》

遗传学的基本研究对象是生物体内的各种变异，包括宏观水平如个体或细胞的形态变化，以及分子水平如基因或蛋白质的突变。一般说来，基因的突变是引起个体性状改变的根源。因此，遗传学家的主要任务是通过研究基因的变异来发现基因的功能。自20世纪初现代遗传学诞生以来，在一个世纪的时间内，生物学家们发展出了许多研究基因突变的遗传学方法，揭示了众多基因的功能。然而，随着后基因组时代的到来，人们已不再满足于传统的遗传学手段，希望有一种能够快速、大规模研究基因突变的方法。由此，一门新兴交叉科学——化学遗传学（chemical
genetics）便应运而生，利用大量的小分子化合物去研究基因的功能。

双 向 选 择

传统的遗传学手段大致可以分为“正向遗传学”（forward genetics）和“反向遗传学”（reverse
genetics）两类。正向遗传学是指，通过生物个体或细胞的基因组的自发突变或人工诱变，寻找相关的表型或性状改变，然后从这些特定性状变化的个体或细胞中找到对应的突变基因，并揭示其功能。例如遗传病基因的克隆。反向遗传学的原理正好相反，人们首先是改变某个特定的基因或蛋白质，然后再去寻找有关的表型变化。例如基因剔除技术或转基因研究。简单地说，正向遗传学是从表型变化研究基因变化，反向遗传学则是从基因变化研究表型变化。

化学遗传学也同样继承了这两种不同的研究策略。正向的化学遗传学采用各种小分子化合物处理细胞，诱导细胞出现表型变异，然后经过筛选，寻找小分子作用的靶标（通常是蛋白质）。一个正向化学遗传学研究范例来自哈佛大学的科学家，他们采用哺乳动物细胞为筛选模型，观察了上万种化合物对细胞*的影响，从中发现了一个能强烈抑制哺乳动物细胞*的化合物monastrol；进一步的研究揭示，monastrol专一地抑制有丝*驱动蛋白Eg5[1]。

反向的化学遗传学采用了反向遗传学的思路，从基因或蛋白质与小分子化合物的相互作用来研究基因或蛋白质对表型的影响，从而找到这些生物大分子的功能。反向化学遗传学的起源可以追溯到20世纪初期德国生物学家埃尔利希（P.
Ehrlich），他提出了受体（receptor）的概念：一个特定的蛋白质可以与一个小分子相结合；这种蛋白质被称为受体，与之结合的小分子被称为配体（ligand）。今天，埃尔利希的观点已经被生物学家广为认同，人们甚至认为每一个蛋白质可能都有一个特定的小分子。事实上，化学遗传学的主要目标就是要为每一个基因找到相应的小分子化合物。反向化学遗传学的一个成功的例子是，美国科学家采用一种化合物PD184352筛选与其作用的蛋白激酶，发现它可以专一地抑制一种调节细胞增殖的蛋白激酶MEK1；进一步的研究表明它可阻碍结肠癌的生长，从而揭示出MEK1在肿瘤的形成中有着重要作用[2]。

“化 学 银 行”

随着人类基因组计划的实施和后基因组时代的来临，经典的遗传学研究已走向规模化、系统化。其标志之一，就是出现了存储成千上万基因信息和序列的数据库——“基因银行”（GenBank）。化学遗传学也被烙上了同样的标记。2001年，美国国立卫生研究院下属的国家癌症研究所（NCI）启动了一个计划，希望全世界的科学家将所有小分子化合物的结构及其生物学效应或与蛋白质作用的信息，存入一个公共的数据库。这个公共数据库被称为“化学银行”（ChemBank）。预计在第一年为该计划投入1000万美元，以后逐年增大投入。NCI的所长克劳斯勒（R.
Klausner）认为，通过实施“化学银行”计划，人们就可以系统地寻找和分析能够作用于蛋白质或细胞的具有生物活性的化合物。

开展化学遗传学研究的关键之一是要有大量的不同结构的化合物供筛选。monastrol就是从含有16320种小分子的化合物库中筛选得到的。新兴的组合化学显然是化学遗传学获得海量小分子化合物的核心技术。它的原理是，在同一个化学反应体系中加入不同的结构单元，利用这些结构单元的排列组合，就能够系统地合成大量的化合物。此外，现代化学合成技术的改进和发展，也为化学遗传学奠定了良好的基础。

要想从上万种甚至上百万种小分子化合物组成的化合物库中筛选出有效的分子，显然需要高通量的筛选方法，涉及到自动化、微量化和图像处理等各种高技术的运用。以微量化为例，1970年代分析一个化合物样品需要的体积是0.3毫升左右，1990年代减少到10微升，而最近几年已发展到只需要0.1微升。目前，人们针对两种不同的化学遗传学需求发展出了不同的高通量筛选方法。正向化学遗传学采用的是基于细胞的高通量筛选方法：将多细胞生物的某种细胞或单细胞生物体如细菌作为筛选模型，应用大规模平行检测技术，同时分析成千上万种化合物对细胞形态或活性的影响。而反向化学遗传学则是采用以蛋白质为靶标的高通量筛选方法，将特定的蛋白质植入具有96个孔或更多孔的培养皿，然后通过测定酶反应或结合能力，寻找与蛋白质发生作用的化合物。一般从1万到100万个化合物中，可以筛选到10到100个潜在的配体。

取 长 补 短

经典遗传学研究手段在长达一个世纪的实践中取得了巨大的成绩，至今依然是生命科学研究中一个重要组成部分。但是，经典遗传学的研究具有一些先天不足之处。首先，遗传突变通常是不可逆的，尤其是多细胞生物的基因突变。其次，绝大部分突变是不可控的，它们的活性无法按照研究者的愿望进行转换；即使有一些条件型突变，如温度敏感型突变，对温度的改变不仅仅影响突变，而且会影响到有机体的整体变化。此外，遗传突变的生物学效应比较缓慢，对于细胞内一些快速化学反应如信号传递，很难及时检测。遗传突变通常是质的改变——蛋白质活性的增加或丧失，难以研究其动态变化或动力学过程。最后，由于哺乳动物具有繁殖缓慢、个体大、巨大的双倍体基因组等特性，使得应用遗传学手段变得非常困难。

化学遗传学正好可以在一定程度上补偿这些经典遗传学研究的缺憾。化学遗传学的手段是可控的和可逆的——可以随时加入或除去化合物，从而启动或中断特定的反应。大多数小分子化合物对蛋白质的作用非常快，从而可以进行实时检测。此外，通过控制化合物的浓度，可以对其作用的靶分子的动力学过程进行分析。化学遗传学的另一个优点是，一个同样的化合物，可以被广泛地用于影响各种不同生物体的某一种过程或功能。化学遗传学的方法也基本上不受物种的*，既可以用于低等生物，也可以高等生物。

不久前，人们在研究细胞的信号转导时，把经典遗传学和化学遗传学的研究方法结合起来，实现了优势互补。在信号转导过程中，蛋白激酶起着非常关键的作用。由于所有的蛋白激酶都有一个非常保守的ATP结合结构域，抑制蛋白激酶活性的小分子化合物通常是非专一性的：一种化合物可以抑制许多蛋白激酶的活性。为了寻找只作用于某一种蛋白激酶的专一性抑制剂，美国科学家发明了一种技术：首先用经典遗传学的方法把某种蛋白激酶的ATP结合位点上的一个氨基酸进行突变，制造出一个保持激酶活性但空间结构改变的突变型激酶，随后合成一系列可专门结合这一突变激酶的化合物，并筛选出只抑制人工突变蛋白激酶，而不抑制其野生型或其他蛋白激酶的小分子化合物[3]。这一方法不仅为在体内研究各种蛋白激酶的功能提供了有用的工具，还表明经典遗传学和化学遗传学的结合有可能为生命科学开拓更大的研究空间。

化学遗传学不仅是化学与生物*姻的产物，也是基础研究与应用研究嫁接的成果。制药公司的目的通常是获得治疗疾病的药物——绝大多数都是小分子化合物。因此，现代化的制药公司一直采用大规模筛选小分子化合物的方法，去寻找具有药效的候选化合物，并且常常收集有数百万种化合物。在早些时候，这类化合物库是不出售的，学术界的研究人员无从进行大规模筛选的研究工作。现在，随着化合物库的商品化，科学家可以开展相关的研究了。从另一方面来说，化学遗传学研究所获得的成果——小分子化合物及其生物学效应，除了被用来揭示生命的基本活动规律外，还可能成为候选药物。也就是说，化学遗传学的研究活动不是单纯的基础研究，而与应用紧密相联。所以很多大型制药公司都非常关注化学遗传学。例如，哈佛大学在成立一个以从事化学遗传学为核心的“化学与细胞生物学研究所”时，著名的默克制药公司(Merck)就成为了该所的主要赞助者之一。可以说，化学遗传学的出现把传统的学术研究实验室引进了药物开发的战场。

参考资料：http://www.nyu.e/classes/ytchang/book/c003.html

热心网友 时间：2023-06-24 16:25

在初中就学了，你是文盲吗？